1.一种青刺果油粕发酵液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1、以青刺果油粕与水的混合物为发酵底物，加入酶进行酶解，以乳酸菌为发酵菌种于30‑40℃进行单独发酵；步骤2：取发酵产物，离心收集上清液，即为青刺果油粕发酵液；所述的发酵产物制备实现如下：将0.2g乳酸菌干粉、8mg果胶酶、10g青刺果油粕干粉和200mL水混合，然后37℃培养48小时，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物；所述的乳酸菌和青刺果油粕配比为10cfu:10g；当青刺果油粕发酵液为青刺果油粕乳酸菌发酵原浆时，呈淡黄色至棕黄色液体、pH＝

3.6‑3.9。

2.一种青刺果油粕发酵液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1、以青刺果油粕与水的混合物为发酵底物，加入酶进行酶解，酿酒酵母菌和乳酸菌为发酵菌种于30‑40℃进行混合发酵，得到混合发酵产物；步骤2：取混合发酵产物，离心收集上清液，即为青刺果油粕发酵液；所述的混合发酵产物的制备实现如下：将0.2g乳酸菌干粉、20mL活化后的酵母菌菌液、8mg果胶酶、10g青刺果油粕干粉和200mL水混合，37℃培养48小时，然后收集整个发酵体系，即为混合发酵产物，且酿酒酵母菌粉与乳酸菌菌粉混合的质量比为3:1；所述的酵母菌菌液的制备实现如下：将0.6g酿酒酵母EC1118干粉加入至10mL无菌水中，然后加入10mL青刺果油粕原液，35℃水浴活化酵母20min；当青刺果油粕发酵液为青刺果油粕酵母菌和乳酸菌混合发酵原浆时，呈淡黄色至棕黄色液体、pH＝3.8‑4.1。

3.根据权利要求1或2所述的一种青刺果油粕发酵液的制备方法，其制备的青刺果油粕发酵液应用于制备美白抗衰老化妆品。

一种青刺果油粕发酵液及其制备方法和在化妆品中的应用

技术领域

[0001]本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种青刺果油粕发酵液及其制备方法和在化妆品中的应用。

背景技术

[0002]青刺果又名阿那斯果，分布于在云南、贵州、四川、西藏等地。它主要生长于海拔1000‑3000米的高寒山区或路边，耐旱耐寒，对环境的适应能力极强。其根、叶、果、均可食用或入药，具有清热解毒、活血化瘀、消炎止痛、健胃消食等作用。此外，青刺果油成分与人体脂质十分接近，能够很好地保持皮肤表面的水分和营养，并具有很好的抗衰老作用。作为青刺果油提炼工艺中的废弃物，青刺果油粕仍含有很多如维生素、蛋白质、黄酮等活性物质。但青刺果油粕却未得到到很好的利用，成为亟待开发的植物资源之一。

[0003]近年来，发酵技术在化妆品植物活性原料开发上有着很好的应用前景，微生物不仅能够有效富集植物活性成分、提高功效，还可以降低来自植物中其他物质的毒副作用。同时，微生物发酵还能降低有机试剂的使用，减少污染及能耗，已然成为化妆品工业上的研究热点之一。本发明利用酿酒酵母或乳酸菌或其混合菌发酵青刺果油粕，制备出青刺果油粕发酵原浆，其抗氧化活性和酪氨酸酶抑制率都有不同程度的提高，为青刺果油粕的有效利用提供了一个新的理论基础。

发明内容

[0004]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种青刺果油粕发酵液及其制备方法与在化妆品中的应用；

[0005]本发明提供了供一种青刺果油粕发酵液的制备方法，具体包括如下步骤：

[0006]步骤1、以青刺果油粕与水的混合物为发酵底物，以酿酒酵母菌为发酵菌种于23‑30℃进行单独发酵,或以乳酸菌为发酵菌种于30‑40℃进行单独发酵,或以酿酒酵母菌和乳酸菌为发酵菌种于30‑40℃进行混合发酵，得到发酵产物；

[0007]所述的乳酸菌包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌的一种或多种的等比例混合。

[0008]酿酒酵母菌和青刺果油粕配比为10‑10cfu：5‑15g，具体为10cfu:10g；

[0009]乳酸菌和青刺果油粕配比为10‑10cfu：5‑15g，具体为10cfu:10g；

[0010]所述酿酒酵母菌发酵条件为：T＝23‑30℃，20‑40小时，具体为25℃，48小时；

[0011]所述乳酸菌发酵条件为：T＝30‑40℃，40‑50小时，具体为37℃，48小时；

[0012]所述的以酿酒酵母菌和乳酸菌混合发酵条件为：T＝30‑40℃，40‑50小时，具体为37℃，48小时；

[0013]发酵体系为0.4‑1.0g酿酒酵母菌粉或0.1‑0.5g乳酸菌菌粉或二者混合、5‑10mg果胶酶、5‑15g青刺果油粕、180‑250mL无菌水；

[0014]当二者混合时，酿酒酵母菌粉与乳酸菌菌粉混合的质量比为3:1；

[0015]具体的：0.6g酿酒酵母菌粉或0.2g乳酸菌干粉或0.6g酿酒酵母菌粉与0.2g乳酸菌干粉混合、8mg果胶酶、10g青刺果油粕、200mL无菌水进行配比发酵；

[0016]步骤2：取发酵产物，离心收集上清液，即为青刺果油粕发酵液。

[0017]所述离心方法为：3000‑6000rpm，5‑25min，具体为4000rpm，15min；

[0018]所述当青刺果油粕发酵液为青刺果油粕酵母菌发酵原浆时，呈淡黄色至棕黄色液体、pH＝4.1‑4.4；为青刺果油粕乳酸菌发酵原浆时，呈淡黄色至棕黄色液体、pH＝3.6‑3.9；为青刺果油粕酵母菌和乳酸菌混合发酵原浆式，呈淡黄色至棕黄色液体、pH＝3.8‑4.1。

[0019]本发明还保护一种产品，其特征为如权利要求6所述为青刺果油粕酵母菌发酵原浆，其具有抗氧化/DPPH自由基清除或/和美白功效。

[0020]本发明还保护青刺果油粕酵母菌发酵原浆的制备方法。

[0021]本发明还保护青刺果油粕酵母菌发酵原浆的应用。

[0022]本发明还保护一种产品，其特征为如权利要求6所述为青刺果油粕乳酸菌发酵原浆，其具有抗氧化/DPPH自由基清除或/和美白功效。

[0023]本发明还保护青刺果油粕乳酸菌发酵原浆的制备方法。

[0024]本发明还保护青刺果油粕乳酸菌发酵原浆的应用。

[0025]以上任一所述产品具体可为化妆品。所述化妆品包括但不限于：面膜、护肤霜或爽肤水。

[0026]本发明利用生物技术发酵技术，通过选择合适的微生物和及其发酵条件，充分利用微生物的降解及转化作用，使青刺果油提炼中的副产物得到很好的利用，发酵过程中不添加其他有机试剂，提高了安全性和环保性，得到的发酵原浆比原来拥有更高的抗氧化活性和自由基清除能力，并具有较好的美白效果。

附图说明

[0027]图1不同工艺处理的青刺果油粕发酵液中多糖含量的比较

[0028]图2不同工艺处理的体积分数为3％的青刺果油粕发酵液对DPPH自由基清除效果影响

[0029]图3不同工艺处理的青刺果油粕发酵液体外对酪氨酸酶活性的影响

[0030]图4不同体积分数的青刺果油粕混合菌发酵液中对DPPH自由基清除效果具体实施方式

[0031]下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制于本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0032]酿酒酵母EC1118(Saccharomyces cerevisiae EC1118)：购自法国拉曼集团。DPPH：购自西格玛奥德里奇(中国)化学有限公司，产品CAS号为1898‑66‑4。

[0033]青刺果干粉的制备方法：取青刺果(果实)，充分烘干后粉碎，得到青刺果干粉。青刺果产自云南丽江。

[0034]乳酸菌干粉为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌等比例混合后经冷冻干燥后的粉末。

[0035]实施例1、青刺果油粕酵母发酵液的制备方法

[0036]一、制备青刺果油粕原液

[0037]将烧瓶置于套式加热器中。把脱脂棉放入提取器底部，称取30g青刺果干粉于索氏提取器的提取器中，连接好烧瓶、提取器、回流冷凝管，并接通冷凝水，加热至60℃。沸腾后，溶剂的蒸气从烧瓶进到冷凝管中，冷凝后的溶剂回流到提取器中，浸取样品。溶剂在提取器内到达一定的高度时，就携带所提取的物质一同从侧面的虹吸管流入烧瓶中。溶剂就这样在仪器内循环流动，把所要提取的物质集中到下面的烧瓶内。提取时间为60min。

[0038]收集提取后的青刺果油粕于60℃烘干，将10g青刺果油粕、8mg果胶酶和200mL无菌水混合，即为青刺果油粕原液。

[0039]二、制备酵母菌菌液

[0040]将0.6g酿酒酵母EC1118干粉加入至10mL无菌水中，然后加入10mL青刺果油粕原液，35℃水浴活化酵母20min。

[0041]三、制备青刺果油粕酵母发酵原浆

[0042]

1.将20mL活化后的酵母菌菌液和200mL青刺果油粕原液混合，然后置于25℃静置发酵48h，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物。

[0043]

2.取步骤1的产物，4000rpm离心10min，收集上清液，即为青刺果油粕发酵原浆。

[0044]四、青刺果油粕酵母菌发酵原浆的性质

[0045]青刺果油粕酵母菌发酵原浆：外观为淡黄色至棕黄色液体、pH＝4.1‑4.6；粗多糖浓度为62.8mg/L，总黄酮浓度为0.21mg/mL。

[0046]实施例2、制备青刺果油粕乳酸菌发酵原浆

[0047]一、制备青刺果油粕原液

[0048]同实施例1中第一步

[0049]二、制备青刺果油粕乳酸菌发酵原浆

[0050]

1.将0.2g乳酸菌干粉、8mg果胶酶、10g青刺果干粉和200mL水混合，然后37℃培养48小时，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物。

[0051]

2.取步骤1的产物，4000rpm离心10min，收集上清液，即为青刺果油粕乳酸菌发酵原浆。

[0052]三、青刺果油粕乳酸菌发酵原浆的性质

[0053]青刺果油粕乳酸菌发酵原浆：外观为淡黄色至棕黄色液体、pH＝3.6‑3.9；粗多糖浓度为173.4mg/L，总黄酮浓度为0.22mg/mL。

[0054]实施例3、制备青刺果油粕混合发酵原浆

[0055]一、制备青刺果油粕原液

[0056]同实施例1中第一步

[0057]二、制备酵母菌菌液

[0058]将0.6g酿酒酵母EC1118干粉加入至10mL无菌水中，然后加入10mL青刺果油粕原液，35℃水浴活化酵母20min。

[0059]三、制备青刺果油粕混合发酵原浆

[0060]

1.将0.2g乳酸菌干粉、20mL活化后的酵母菌菌液、8mg果胶酶、10g青刺果干粉和200mL水混合，37℃培养48小时，然后收集整个发酵体系，即为发酵产物。

[0061]

2.取步骤1的产物，4000rpm离心10min，收集上清液，即为青刺果油粕混合发酵原浆。

[0062]四、青刺果油粕乳酸菌发酵原浆的性质

[0063]青刺果油粕乳酸菌发酵原浆：外观为淡黄色至棕黄色液体、pH＝3.8‑4.1；粗多糖浓度为105.1mg/L，总黄酮浓度为0.25mg/mL。

[0064]实施例4、青刺果油粕发酵原浆作为化妆品的应用

[0065]一、青刺果油粕酵母菌/乳酸菌/混合发酵原浆的抗氧化性能检测

[0066]抗氧化活性采用DPPH法评价样品对自由基清除效率。DPPH自由基为稳定的有机自由基，大部分为人工合成，分子式为C H NO。其乙醇或甲醇溶液为紫红色，当向DPPH自由基溶液中加入去自由基剂时，紫红色溶液会被还原成淡黄色溶液，其褪色程度与接收电子数量成线性关系，因而可以通过吸光度进行定量检测。

‑5

[0067]DPPH溶液为溶解于无水乙醇、浓度为6×10 mol/L的DPPH溶液。

[0068]不同体积分数的青刺果油粕酵母菌/乳酸菌/混合发酵原浆的稀释溶剂为无水乙醇。

[0069]DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：

[0070]

1.青刺果油粕酵母菌/乳酸菌/混合发酵原浆0.5mL与2.5mL DPPH溶液混合(实验组)；

[0071]

2.0.5mL无水乙醇与2.5mL DPPH溶液混合(空白组)；

[0072]

3.室温避光静置30min后，测定三个组别的A 。

[0073]

4.DPPH自由基清除率计算公式：清除率％＝(实验组‑空白组)/空白组

[0074]由图2可知，青刺果油粕经发酵过后其DPPH清除率均有不同程度的提高，且均为显著性提高。由图4可知，实施例3制备的青刺果油粕混合菌发酵原浆在5％浓度以上范围对DPPH的清除率均在80％以上。青刺果油粕发酵原浆具有很好的抗氧化活性，能够清除细胞自由基，延缓细胞衰老，具有抗衰老的作用。

[0075]二、青刺果酵母菌、乳酸菌发酵原浆的酪氨酸酶抑制率

[0076]酪氨酸酶是已知的在皮肤黑色素生物合成代谢中的一种关键酶，其活性程度与黑色素的形成的数量和沉积起主要作用。大多数美白剂是通过阻断或者抑制酪氨酸酶活性，抑制黑色素的形成以达到美白的效果。

[0077]PB缓冲液为0.1mol/L、pH＝6.8的NaHPO、NaHPO缓冲液；

[0078]酪氨酸酶液为溶解于PB缓冲液中，浓度为200U/mL的酶溶液；

[0079]L‑酪氨酸溶液为溶解于PB缓冲液中，浓度为0.5mg/mL的酪氨酸溶液；

[0080]酪氨酸酶抑制实验的具体步骤为：

[0081]

1.实验组：将100μL青刺果油粕酵母菌/乳酸菌/混合发酵原浆、1.75mL的0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液稀释和1mL的酪氨酸酶混合，25℃孵育10min，后加入1mL的L‑酪氨酸溶液，继续孵育10min，测定其A 。

[0082]

2.对照组：将2mL的0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液稀释和1mL的酪氨酸酶混合，25℃孵育10min，后加入1mL的L‑酪氨酸溶液，继续孵育10min，测定其A 。

[0083]

3.实验组空白：将100μL青刺果油粕酵母菌/乳酸菌/混合发酵原浆与2.75mL的

0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液稀释混合，25℃孵育10min，后加入1mL的L‑酪氨酸溶液，继续孵育10min，测定其A 。

[0084]

4.对照组空白：将3mL的0.1mol/L pH6.8磷酸缓冲液稀释置于25℃孵育10min，后加入1mL的L‑酪氨酸溶液，继续孵育10min，测定其A 。

[0085]

5.酪氨酸酶抑制率％计算公式：

[0086][(对照组‑对照组空白)‑(实验组‑实验组空白)]×100/(对照组‑对照组空白)

[0087]由图3可知，青刺果油粕经发酵后提高了其酪氨酸酶抑制率，且均为显著性提高，说明青刺果油粕发酵原浆具有抑制酪氨酸酶的能力，能够抑制黑色素的形成，具有很好的美白效果。